RTqPCR的常规实验流程是什么?
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实时荧光定量PCR(RT-qPCR)的常规实验流程主要包括以下几个步骤:
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RNA的提取:首先需要从不同的组织样本中提取RNA。在总RNA的提取过程中,需要注意避免RNA的降解和污染5。
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RNA浓度测定:提取后的RNA需要进行浓度测定,以确保后续实验中RNA的准确用量7。
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反转录合成cDNA模板:将提取的RNA通过反转录过程合成cDNA,作为PCR扩增的模板7。
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PCR扩增:在PCR反应体系中加入荧光物质,通过荧光信号的实时接收监测PCR反应进程。PCR扩增循环数是实验中的一个重要参数211。
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Ct值的确定:Ct值,即阈值循环数(Cycle threshold),是PCR扩增过程中荧光信号达到阈值时的循环次数。Ct值与模板的起始拷贝数存在线性关系,是定量分析的关键11。
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结果判定:根据实验目的和数据分析结果,对实验结果进行判定。例如,在非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测中,会根据Ct值和标准曲线来判定样本是否含有病毒核酸10。
以上步骤构成了RT-qPCR的常规实验流程,每一步都是确保实验结果准确性和可靠性的关键环节。
实时荧光定量PCR的数据分析1 | 数据分析方法 qPCR的绝对定量法和相对定量法是数据分析的两种主要方法。 |
实时荧光定量PCR的实验流程2 | 实验流程概述 qPCR通过加入荧光物质监测PCR反应进程,模板的Ct值与起始拷贝数存在线性关系。 |
实时荧光定量PCR的定义和检测方法3 | 定义与检测 qPCR通过序列检测系统进行PCR产物检测,使用SYBR Green I染料试剂,分为嵌入剂和结合剂。 |
实时荧光定量PCR的步骤4 | PCR步骤 包括变性、退火和延伸三个主要步骤,一般运行40个循环。 |
实时荧光定量PCR的RNA提取5 | RNA提取 RNA的提取是实验流程的第一步,不同组织样本适用不同的提取方法。 |
多重实时荧光定量PCR的标准曲线建立6 | 标准曲线建立 为每种靶基因建立标准曲线,通过连续等比稀释制备标准品稀释液。 |
实时荧光定量PCR实验流程5 | 实验流程 RNA提取、浓度测定、反转录合成cDNA模板等步骤。 |
多重实时荧光定量PCR实验流程6 | 标准曲线建立 为每种靶基因建立标准曲线,通过连续等比稀释制备标准品稀释液。 |
甲基化特异性PCR (MSP) 实验流程9 | MSP原理 亚硫酸氢钠处理基因组DNA,使用特异性引物检测基因甲基化状态。 |
实时荧光定量PCR(qPCR)1 | 实验流程 qPCR数据分析包括绝对定量法和相对定量法。 |