提取RNA时分层后,为什么不吸取白色层中的RNA沉淀
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在RNA提取过程中,分层后通常不吸取白色层中的RNA沉淀,原因如下:
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分层原理:根据1和3的描述,RNA提取时,加氯仿后会形成三层结构:水相(上层,含RNA)、中间白色薄层(含蛋白和可能的DNA)、有机相(下层,含氯仿和蛋白等)。氯仿的作用是促进有机相和无机相的迅速分离,而异丙醇则通过疏水作用保护RNA或DNA链中的亲水基团,帮助RNA沉淀。
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避免DNA污染:1中提到,在RNA提取过程中需要避免蛋白和DNA的脱离,因为这样会导致DNA释放到水相中,从而污染RNA。因此,不吸取中间层可以减少DNA的污染。
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RNA的位置:根据3,总RNA在酸性条件下保留在上层水相中,而大部分DNA和蛋白质保留在中间相或下层有机相中。因此,RNA主要存在于上层水相,而不是中间层。
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操作技巧:4中提到,分层不彻底时,可以通过增加裂解液使用量或降低样品量来解决,且在吸取上清时决不能取到中间层,以避免污染。
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RNA提取效率:7中提到,如果样品匀浆后有很多不溶性物质,可以在加入氯仿前通过离心去除不溶物,以获得透明的上清液和果冻样沉淀,从而提高RNA提取的效率。
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RNA的保护:5指出,在RNA提取过程前后是RNA完整性受损风险最大的时候,因此在操作过程中应尽量减少对RNA的物理和化学干扰。
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RNA沉淀的收集:10中提到,RNA可以通过异丙醇沉淀来还原,且RNA存在于水样层中。因此,收集上层水样层并进行沉淀是提取RNA的标准步骤。
综上所述,不吸取白色层中的RNA沉淀是为了减少DNA污染、提高RNA提取的纯度和效率,并保护RNA的完整性。正确的操作是收集上层水相中的RNA,并通过后续的沉淀步骤来纯化RNA。