Caco-2细胞，transwell培养，培养基AKP酶活

Caco-2细胞是一种来源于人结肠腺癌细胞的细胞系，常用于模拟人体小肠上皮细胞的功能，特别是在药物吸收和转运研究中。在Transwell培养系统中，Caco-2细胞能够在微孔滤膜上形成极化的单层细胞，模拟肠道上皮屏障。碱性磷酸酶（AKP）是评估Caco-2细胞极性和成熟度的重要生化指标之一。

培养基和AKP酶活测定

1. 培养基准备：在进行Caco-2细胞的Transwell培养前，需要准备适宜的培养基，通常包含有血清、氨基酸、维生素和矿物质等成分，以支持细胞生长和分化。培养基需提前预热至37°C。

2. 细胞接种：将Caco-2细胞接种于Transwell 24孔微孔滤膜培养板上，根据研究目的选择适当的接种密度。高密度接种（1×10^5 cells·cm^-2）、中密度（5×10^4 cells·cm^-2）和低密度（3×10^4 cells·cm^-2）是常见的接种密度。

3. 培养过程：细胞接种后，置于含有5% CO2的细胞培养箱中培养。培养过程中需定期更换培养基，以维持细胞生长所需的营养和去除代谢废物。

4. AKP酶活测定：通过测定Caco-2细胞单层各阶段的碱性磷酸酯酶(AKP)活性，可以反映Caco-2细胞的生化特性以及细胞极性。AKP活性的测定通常使用AKP试剂盒，按照说明书步骤操作。在Caco-2细胞接种后的第3、15、22天从Transwell膜的两侧取样，测定不同时间段的AKP活性。

5. 结果分析：AKP活性的高低可以反映Caco-2细胞的成熟度和极性。高AKP活性通常表明细胞已形成良好的极性结构，这对于药物吸收和转运研究至关重要。

注意事项

• 在进行Transwell培养时，需注意细胞接种密度、培养时间和培养条件对细胞极性和功能的影响。
• AKP酶活测定是评估Caco-2细胞极性的重要手段，但还需结合其他指标如跨膜电阻值(TEER)和细胞形态学观察等，全面评估细胞模型的可靠性。
• 实验操作过程中应严格遵守无菌操作规程，避免细胞污染。

通过上述步骤，可以有效地进行Caco-2细胞的Transwell培养，并准确测定AKP酶活性，为药物吸收和转运研究提供可靠的细胞模型。

Caco-2细胞传代培养的具体步骤是什么?

Caco-2细胞传代培养的具体步骤包括以下几个关键环节：

1. 准备所需的培养基、胰酶、PBS、离心管、培养瓶以及无菌枪头等；所有试剂需提前预热。
2. 抽走培养瓶内培养基，加5mL PBS润洗1-2遍，以清除残留培养基。
3. 吸干润洗的PBS后，加入1mL胰酶，确保胰酶均匀覆盖瓶底，然后放置培养。
4. 待细胞变圆并开始从瓶壁脱落时，加入含有10% FBS的培养基终止胰酶反应。
5. 将细胞悬液转移到离心管中，低速离心后弃去上清，重悬于新鲜培养基中。
6. 将细胞悬液分装到新的培养瓶中，放入细胞培养箱中继续培养1。

如何判断Caco-2细胞是否成功形成极性单层?

判断Caco-2细胞是否成功形成极性单层，可以通过以下几个方面进行评估：

1. 观察细胞形态：成熟的Caco-2细胞单层在光学显微镜下可见细胞排列紧密，形成明显的极性结构。
2. 测定跨膜电阻值(TEER)：成功的极性单层具有较高的TEER值，通常大于200Ω·cm²。
3. 检测碱性磷酸酶(ALP)活性：极性单层的Caco-2细胞在肠腔侧和基底侧的ALP活性存在显著差异，肠腔侧活性显著高于基底侧。
4. 酚红透过率测试：极性单层的Caco-2细胞对酚红的透过率较低，通常小于5%1528。

在Transwell培养系统中，如何测定Caco-2细胞的跨膜电阻值?

在Transwell培养系统中测定Caco-2细胞的跨膜电阻值(TEER)的步骤如下：

1. 将Caco-2细胞接种于Transwell 24孔微孔滤膜培养板上。
2. 定期使用电阻测量仪测定培养板的上室和下室之间的电阻值。
3. 记录不同时间点的TEER值，以评估细胞单层的完整性和极化程度。
4. 通常，成功的Caco-2细胞单层模型在培养至一定时间后，TEER值会超过600Ω·cm²48。

碱性磷酸酶活性在Caco-2细胞培养过程中有何作用?

碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase, ALP)活性在Caco-2细胞培养过程中具有重要作用：

1. 反映细胞分化程度：ALP活性的高低可以反映Caco-2细胞的分化状态，分化良好的细胞ALP活性较高。
2. 评估细胞极性：通过比较细胞单层肠腔侧和基底侧的ALP活性，可以评估细胞的极性发展情况。
3. 作为成熟度指标：ALP活性的增加通常伴随着Caco-2细胞单层的成熟，是评估细胞模型是否适用于药物吸收和转运研究的重要指标之一569。

如何通过酚红透过率评估Caco-2细胞单层的完整性?

通过酚红透过率评估Caco-2细胞单层的完整性的步骤包括：

1. 将酚红作为穿透性标记物添加到Transwell培养系统的上室中。
2. 经过一定时间后，收集下室的培养液样本。
3. 使用分光光度计测定下室样本中酚红的浓度。
4. 根据酚红的透过率，评估Caco-2细胞单层的完整性。通常情况下，完整性良好的细胞单层对酚红的透过率较低，通常小于0.5%30。