一、选择基因 用记事本打开“基因组编码基因”文件，在基因组编码基因里面每位同学各自选择一个基因，作为自己要敲除的目的基因，复制序列，用SnapGene软件打开“基因组序列”文件，Sequence—Edit—Find—Find DNA Sequence粘贴并查找序列，Features—Add Features，命名基因的名字。 二、确定上下臂并设计引物 在选择基因的前后500bp左右作为基因的上下臂，选择18-20bp的序列作为引物，注意区分上下游引物。选好引物序列，点击Primers—Add Primers—正向或者反向—命名（upF/upR/downF/downR）。设计完成上下臂的两对引物。 三、载体双酶切位点的选择 用SnapGene打开pK18质粒图谱，找到MCS区域，选择2个不同的酶切位点。 四、引物上添加其他碱基对 酶切位点添加在上臂上游引物（upF），和下臂下游引物(dnR)，并在酶切位点前添加质粒相应序列（20bp），使之与质粒互补。上臂下游引物（upR）5’端需添加下臂开始序列一部分。同理，下臂上游引物(dnF),5’端需添加上臂结束序列一部分。 五、模拟质粒与上下臂连接 Actions—Gibson Assembly—Insert Two Fragments，分别用对应限制酶线性化质粒，对应引物扩增上下臂，如果可以成功连接就可以在product看到成功的图谱。如果未成功连接，检查具体对应引物设计问题并重新设计引物。 六、引物设计原则 1.18-26bp 2.引物3’端最后一个碱基最好为G或者C； 3.引物3’端最后8个碱基应避免出现连续错配； 4.引物3’端应避免出现发夹结构； 5.正向引物和反向引物的Tm值相差不超过1℃为佳，Tm值调整至55 ~ 65℃为佳(引物Tm值推荐使用Primer Premier 5进行计算)； 6.引物额外附加序列，即与模板非配对序列，不应参与引物Tm值计算； 7.引物的GC含量控制在40% - 60%之间； 8.引物A、G、C、T整体分布要尽量均匀，避免使用GC或者AT含量高的区域； 9.避开引物内部或者两条引物之间有5个碱基以上的互补序列，两条引物的3’端避免有3个碱基以上的互补序列； 七、提交材料 选择的基因和限制性内切酶、4条引物序列、构建成功的重组质粒图谱截图。
理解问题一、选择基因 用记事本打开“基因组编码基因”文件，在基因组编码基因里面每位同学各自选择一个基因，作为自己要敲除的目的基因，复制序列，用SnapGene软件打开“基因组序列”文件，Sequence—Edit—Find—Find DNA Sequence粘贴并查找序列，Features—Add Features，命名基因的名字。 二、确定上下臂并设计引物 在选择基因的前后500bp左右作为基因的上下臂，选择18-20bp的序列作为引物，注意区分上下游引物。选好引物序列，点击Primers—Add Primers—正向或者反向—命名（upF/upR/downF/downR）。设计完成上下臂的两对引物。 三、载体双酶切位点的选择 用SnapGene打开pK18质粒图谱，找到MCS区域，选择2个不同的酶切位点。 四、引物上添加其他碱基对 酶切位点添加在上臂上游引物（upF），和下臂下游引物(dnR)，并在酶切位点前添加质粒相应序列（20bp），使之与质粒互补。上臂下游引物（upR）5’端需添加下臂开始序列一部分。同理，下臂上游引物(dnF),5’端需添加上臂结束序列一部分。 五、模拟质粒与上下臂连接 Actions—Gibson Assembly—Insert Two Fragments，分别用对应限制酶线性化质粒，对应引物扩增上下臂，如果可以成功连接就可以在product看到成功的图谱。如果未成功连接，检查具体对应引物设计问题并重新设计引物。 六、引物设计原则 1.18-26bp 2.引物3’端最后一个碱基最好为G或者C； 3.引物3’端最后8个碱基应避免出现连续错配； 4.引物3’端应避免出现发夹结构； 5.正向引物和反向引物的Tm值相差不超过1℃为佳，Tm值调整至55 ~ 65℃为佳(引物Tm值推荐使用Primer Premier 5进行计算)； 6.引物额外附加序列，即与模板非配对序列，不应参与引物Tm值计算； 7.引物的GC含量控制在40% - 60%之间； 8.引物A、G、C、T整体分布要尽量均匀，避免使用GC或者AT含量高的区域； 9.避开引物内部或者两条引物之间有5个碱基以上的互补序列，两条引物的3’端避免有3个碱基以上的互补序列； 七、提交材料 选择的基因和限制性内切酶、4条引物序列、构建成功的重组质粒图谱截图。
已完成理解「一、选择基因 用记事本打开“基因组编码基因”文件，在基因组编码基因里面每位同学各自选择一个基因，作为自己要敲除的目的基因，复制序列，用SnapGene软件打开“基因组序列”文件，Sequence—Edit—Find—Find DNA Sequence粘贴并查找序列，Features—Add Features，命名基因的名字。 二、确定上下臂并设计引物 在选择基因的前后500bp左右作为基因的上下臂，选择18-20bp的序列作为引物，注意区分上下游引物。选好引物序列，点击Primers—Add Primers—正向或者反向—命名（upF/upR/downF/downR）。设计完成上下臂的两对引物。 三、载体双酶切位点的选择 用SnapGene打开pK18质粒图谱，找到MCS区域，选择2个不同的酶切位点。 四、引物上添加其他碱基对 酶切位点添加在上臂上游引物（upF），和下臂下游引物(dnR)，并在酶切位点前添加质粒相应序列（20bp），使之与质粒互补。上臂下游引物（upR）5’端需添加下臂开始序列一部分。同理，下臂上游引物(dnF),5’端需添加上臂结束序列一部分。 五、模拟质粒与上下臂连接 Actions—Gibson Assembly—Insert Two Fragments，分别用对应限制酶线性化质粒，对应引物扩增上下臂，如果可以成功连接就可以在product看到成功的图谱。如果未成功连接，检查具体对应引物设计问题并重新设计引物。 六、引物设计原则 1.18-26bp 2.引物3’端最后一个碱基最好为G或者C； 3.引物3’端最后8个碱基应避免出现连续错配； 4.引物3’端应避免出现发夹结构； 5.正向引物和反向引物的Tm值相差不超过1℃为佳，Tm值调整至55 ~ 65℃为佳(引物Tm值推荐使用Primer Premier 5进行计算)； 6.引物额外附加序列，即与模板非配对序列，不应参与引物Tm值计算； 7.引物的GC含量控制在40% - 60%之间； 8.引物A、G、C、T整体分布要尽量均匀，避免使用GC或者AT含量高的区域； 9.避开引物内部或者两条引物之间有5个碱基以上的互补序列，两条引物的3’端避免有3个碱基以上的互补序列； 七、提交材料 选择的基因和限制性内切酶、4条引物序列、构建成功的重组质粒图谱截图。」
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基因编辑流程概述
使用SnapGene软件进行基因编辑的流程包括选择基因、设计引物、选择酶切位点、添加碱基对、模拟连接和引物设计原则。123456789101112
一、选择基因
操作步骤：首先，使用记事本打开“基因组编码基因”文件，选择一个基因作为敲除目标。复制该基因序列，利用SnapGene软件打开“基因组序列”文件，通过“Sequence—Edit—Find—Find DNA Sequence”功能粘贴并查找序列。之后，在“Features—Add Features”中添加基因名称。12
二、确定上下臂并设计引物
引物设计：选择基因前后500bp左右作为上下臂。设计18-20bp的引物序列，区分上下游引物。在SnapGene中通过“Primers—Add Primers”添加正向或反向引物，并进行命名（upF/upR/downF/downR）。67891012
三、载体双酶切位点的选择
酶切位点选择：使用SnapGene打开pK18质粒图谱，定位到MCS区域，选择两个不同的酶切位点。15
四、引物上添加其他碱基对
添加碱基对：在上臂上游引物（upF）和下臂下游引物(dnR)上添加酶切位点，并在酶切位点前添加质粒相应序列（20bp），确保与质粒互补。上臂下游引物（upR）5’端添加下臂开始序列的一部分，下臂上游引物(dnF) 5’端添加上臂结束序列的一部分。6789
五、模拟质粒与上下臂连接
模拟连接：通过“Actions—Gibson Assembly—Insert Two Fragments”模拟质粒与上下臂的连接。使用限制酶线性化质粒，用对应引物扩增上下臂。如果连接成功，可以在“product”中看到成功的图谱。若未成功，检查引物设计并重新设计。15
六、引物设计原则
设计原则：
- 引物长度为18-26bp。
- 3’端最后一个碱基优选G或C。
- 3’端最后8个碱基避免连续错配。
- 避免3’端发夹结构。
- 正反向引物Tm值相差不超过1℃，推荐55~65℃。
- 额外附加序列不参与Tm值计算。
- GC含量控制在40%-60%。
- 碱基分布均匀，避免高GC或AT区域。
- 避免引物内部或两条引物间5个碱基以上互补序列，3’端避免3个碱基以上互补序列。6789101112