分析加样缓冲液中所有主要成分的作用。蛋白质的高级结构一般通过疏水 作用、电荷作用、氢键作用和二硫键进行维持。在SDS-PAGE的样品处理 阶段是如何破坏这些作用，以达到蛋白质变性的目的的？

加样缓冲液在SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）中起着至关重要的作用，其主要成分包括SDS、甘油、溴酚蓝和TRIS等。这些成分各自有特定的功能，共同确保蛋白质样品在电泳过程中的有效分离和可视化。12

🧪 主要成分及其作用

• SDS（十二烷基硫酸钠）：SDS是一种阴离子去污剂，能够与蛋白质结合，使蛋白质分子带上负电荷。由于不同蛋白质分子量不同，结合的SDS量也不同，这导致所有蛋白质在电泳中具有相同的电荷密度，从而仅根据分子量进行分离。13

• 甘油：甘油的作用是增加样品的密度，使其沉降到点样孔中而不漂浮起来。这样可以确保样品在电泳开始时能够准确地位于点样孔底部，避免样品飘出点样孔。12

• 溴酚蓝：溴酚蓝是一种指示剂，用于观察电泳过程。它在电泳缓冲液中迁移速度较快，可以作为电泳进程的指示，帮助研究人员适时终止电泳。12

• TRIS（三羟甲基氨基甲烷）：TRIS是一种缓冲剂，用于调节pH值，确保电泳过程中缓冲液的pH值稳定，从而保证蛋白质的稳定性和电泳的准确性。1

🔬 蛋白质变性的机制

在SDS-PAGE的样品处理阶段，通过以下几种方式破坏蛋白质的高级结构，以达到变性的目的：

• 疏水作用的破坏：SDS是一种强极性分子，能够与蛋白质的疏水区域结合，破坏蛋白质内部的疏水作用。这种结合使得蛋白质的疏水区域暴露在外，从而破坏了蛋白质的高级结构。3

• 电荷作用的破坏：SDS与蛋白质结合后，使蛋白质带上大量的负电荷，导致蛋白质分子内部的电荷作用被破坏。这种电荷的均匀分布使得蛋白质在电泳中仅根据分子量进行分离。3

• 氢键作用的破坏：在加热过程中，蛋白质分子内部的氢键会被破坏。加热通常与SDS结合使用，进一步加剧了氢键的破坏，从而导致蛋白质的变性。3

• 二硫键的破坏：在样品处理过程中，通常会加入还原剂如DTT（二硫苏糖醇）或β-巯基乙醇，这些还原剂能够断裂蛋白质分子间的二硫键，进一步破坏蛋白质的高级结构。38

通过这些机制，SDS-PAGE能够有效地将蛋白质变性，使其在电泳中根据分子量进行分离，从而实现蛋白质的定性和定量分析。3

🛠️ 操作步骤

1. 样品制备：在蛋白质提取和定量后，加入适量的SDS-PAGE上样缓冲液。通常使用5×或10×浓缩的上样缓冲液，根据样品浓度进行稀释。3

2. 加热变性：将样品在95°C加热3-5分钟，使蛋白质变性。加热过程中，SDS和还原剂共同作用，破坏蛋白质的高级结构。3

3. 上样：将变性后的样品加入到SDS-PAGE凝胶的点样孔中。由于甘油的作用，样品会沉降到点样孔底部，确保样品在电泳开始时位于正确的位置。2

4. 电泳：启动电泳，根据溴酚蓝的迁移情况监控电泳进程。电泳结束后，通过染色和脱色步骤，观察蛋白质条带。1

通过这些步骤，研究人员可以有效地利用SDS-PAGE技术对蛋白质进行分离和分析，从而获得关于蛋白质分子量和纯度的信息。3